Deasaichte le Peter Sarnow, Sgoil Leigheas Oilthigh Stanford, Oilthigh Stanford, California, air aontachadh air 25 Dùbhlachd, 2020 (ath-sgrùdadh air 25 Dàmhair, 2020)
Bidh sinn ag aithris air an eadar-obrachadh eadar fo-aonadan ann an ath-riochdachadh coronaviruses - iom-fhilltean tar-sgrìobhaidh, a tha riatanach airson ath-riochdachadh agus glèidhteachas mean-fhàs.Thug sinn seachad fianais gu bheil gnìomhachd tar-chuir nucleoside monophosphate (NMP) ann an trans, agus chomharraich sinn nsp9 (pròtain ceangail RNA) mar an targaid aige.Bidh NiRAN a’ catalachadh ceangal covalent an NMP moiety ris a’ cheann-uidhe amino nsp9 glèidhte ann am freagairt a tha an urra ri ions Mn2+ agus fuigheall Asn glèidhte ri thaobh.Chaidh a lorg gu bheil gnìomhachd NiRAN agus nsp9 NMPylation deatamach airson ath-riochdachadh coronavirus.Tha an dàta a’ leigeil leinn a’ ghnìomhachd seo den chomharra enzyme bhìoras neadachaidh a cheangal ris na beachdan a bh’ ann roimhe anns a’ bheachd-bharail gu bheil tòiseachadh synthesis RNA ann an clas de bhìorasan RNA cunbhalach a thaobh gnìomh agus mean-fhàs.
Tha an RNA polymerase (RdRps) a tha an urra ri RNA de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, agus 12 teaghlach eile) ceangailte ris an àrainn amino-terminal (N-terminal) anns a’ phròtain neo-structarail (nsp) a chaidh a leigeil ma sgaoil bhon polyprotein, ris an canar NiRAN. Tha 1ab air a dhèanamh suas de phrìomh protease viral (Mpro).Roimhe sin, chaidh aithris air gnìomhachd GMPylation / UMPylation aig a ’bhìoras arterial NiRAN-RdRp nsp fhèin, agus chaidh a mholadh gluasad gluasadach a ghineadh airson gluasad monophosphate nucleoside (NMP) chun bhìoras (neo-aithnichte an-dràsta) agus / no biopolymerization cealla Rudan.An seo, tha sinn a’ sealltainn gu bheil gnìomhachd NMPylation Mn2+-eisimeilich aig a’ coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E agus Droch Acute Analach Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp), a tha a’ tighinn bho nsp9 tro bhith a’ cruthachadh nsp9 Mn-mediated Às deidh tha an nsps taobh N-terminal air a leigeil ma sgaoil gu proteolytically, tha am fosphoramidate ceangailte ris a’ phrìomh amine (N3825) aig an N-terminal de nsp9.Is e Uridine triphosphate an nucleotide as fheàrr leotha san ath-bhualadh seo, ach tha adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, agus cytidine triphosphate cuideachd nan co-substrates freagarrach.Cho-dhùin sgrùdaidhean mùthaidh a’ cleachdadh pròtanan coronavirus nsp9 agus nsp12 ath-leasaichte agus mutants HCoV-229E a chaidh an innleachadh gu ginteil na fuigheall a bha riatanach airson nsp9 NMPylation le meadhan NiRAN agus ath-riochdachadh bhìoras ann an cultar cealla.Dhaingnich an dàta ro-innse air fuigheall làrach gnìomhach NiRAN agus cho-dhùin iad an àite cudromach a tha aig fuigheall nsp9 N3826 ann an nsp9 NMPylation agus ath-riochdachadh bhìoras in vitro.Tha am fuigheall seo mar phàirt den t-sreath NNE tripeptide glèidhte N-terminal agus chaidh a dhearbhadh mar an aon fhuigheall caochlaideach de nsp9 agus na homologs anns an teaghlach coronavirus.Tha an sgrùdadh seo a’ toirt bunait làidir airson sgrùdadh gnìomh air gnìomhachd NMPylation de bhìorasan neadachaidh eile agus a’ moladh thargaidean a dh’ fhaodadh a bhith ann airson leasachadh dhrogaichean anti-bhìorasach.
Bidh bhìoras RNA adhartach Nidovirales a’ toirt buaidh air grunn dhruim-altachain agus neo-dhruim-altachain (1, 2).Tha an òrdugh an-dràsta a’ toirt a-steach 14 teaghlaichean (3), agus chaidh sgrùdadh farsaing a dhèanamh air an teaghlach Coronavirus anns na 20 bliadhna a dh’ fhalbh.Aig an àm sin, nochd trì coronaviruses zoonotic bho luchd-aoigheachd bheathaichean agus dh’ adhbhraich iad briseadh mòr de dhroch ghalaran analach ann an daoine.A’ toirt a-steach pandemics leantainneach air adhbhrachadh le fìor ghalaran gabhaltach.Coronavirus Syndrome analach 2 (SARS-CoV-2) (4A7).Tha Nidoviruses a’ co-roinn buidheann genome cumanta, agus tha fo-aonad an ionaid ath-sgrìobhaidh ath-sgrìobhaidh ceangailte ri membran (RTC) air a chòdachadh anns an dà thrian de 5-?²-terminal agus prìomh fho-aonad structarail a’ bhìoras, a bharrachd air cuid de ghoireasan. .Pròtain, air a chòdachadh anns an treas cuid den genoma aig 3 ??² (1).Ach a-mhàin aon teaghlach de bhìorasan planar (Monoviridae) (8), bidh a h-uile bhìoras neadachaidh a’ còdachadh fo-aonadan RTC ann an dà fhrèam leughaidh mòr fosgailte (ORF) ORF1a agus ORF1b, a tha air an eadar-theangachadh bho RNA genomic de.Bidh ORF1a a’ còdachadh polyprotein (pp) 1a, agus bidh ORF1a agus ORF1b a’ còdachadh pp1ab còmhla.Le com-pàirteachadh coitcheann den phrìomh protease (Mpro) air a chòdachadh le ORF1a, tha an dà chuid pp1a agus pp1ab air an giullachd gu proteolytically a-steach do ghrunn phròtainean neo-structarail (nsps), ris an canar cuideachd 3CLpro, leis gu bheil homology aige leis an 3Cpro den picornavirus ( 9).Thathas den bheachd gu bheil na nsps sin air an cruinneachadh ann an RTC mòr fiùghantach, a’ catalachadh synthesis RNA genomic (ath-riochdachadh) agus seata de RNA subgenomic (tar-sgrìobhadh), agus gan cleachdadh gus faireachdainn an ORF a tha suidhichte sìos an abhainn de ORF1b (10 ? ? ?12).
Tha am prìomh RTC a’ toirt a-steach RNA polymerase RNA-eisimeilich (RdRp) (13), helicase superfamily 1 (HEL1) (14, 15) agus grunn enzyman giullachd RNA, a tha sa mhòr-chuid air an còdachadh ann an ORF1b agus anns an teaghlach coronavirus Tha e a’ toirt a-steach nsp12-nsp16 agus nsp9-nsp12 anns an teaghlach Arterioviridae (faic iomradh 10â 12).Tha RdRp agus HEL1 a’ riochdachadh dà (aon chòigeamh) raon glèidhte de bhìoras nead nan eun agus tha homology aca am measg bhìorasan RNA eile.Thathas a’ creidsinn gu bheil mac-samhail bunaiteach a’ faighinn taic bho fo-aonadan eile, a’ toirt a-steach grunn nsps beaga a chaidh an leigeil ma sgaoil bhon roinn carboxy-terminal (C-terminal) de pp1a, sìos an abhainn bho Mpro (coronavirus nsp5 agus bhìoras arterial nsp4, fa leth).Tha dìon cuibhrichte aca a tha sònraichte do theaghlaichean agus gnìomhan eadar-mheasgte (air ath-sgrùdadh ann an iomradh 10â12).
An ìre mhath o chionn ghoirid, chaidh àrainn le feartan motif sreath sònraichte a lorg aig an ceann-uidhe amino (N-terminus) ri taobh RdRp anns a h-uile bhìoras neadachaidh, ach cha robh bhìorasan RNA eile ann (16).Stèidhichte air a shuidheachadh agus gnìomhachd nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), tha an raon seo air ainmeachadh mar NiRAN (Nestvirus RdRp co-cheangailte ri nucleotide transferase).Tha an cothlamadh dà-àrainn de NiRAN-RdRp a’ dèanamh suas nsp12 anns an teaghlach Coronaviridae agus nsp9 anns an teaghlach Arterioviridae, agus ann an nestoviridae eile, tha dùil gun tèid NiRAN-RdRp a leigeil ma sgaoil mar nsp neo-eisimeileach bhon polyprotein viral.Anns an coronavirus, tha ??1/450 fuigheall ann an àrainn NiRAN agus tha e ceangailte ris an àrainn C-terminal RdRp tron sgìre ceangail (16?19).Ann an Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), tha nsp9 ath-leasaichte a’ sealltainn gnìomhan Mn2+ a tha an urra ri ion (fèin) UMPylation agus GMPylation, a tha an urra ri trì bunaitean sreath glèidhte ann an nestovirus, AN, BN agus CN Na fuigheall san t-sreath.Far a bheil N a 'seasamh airson NiRAN) (16).Tha an taobh N-terminal de na motifan sin na motif preAN nach eil cho glèidhte.Tha cuid de na fuigheall sin cuideachd air an gleidheadh ann an kinases pròtain a tha fada co-cheangailte riutha, far an deach sealltainn gu bheil iad an sàs ann an gnìomhachd ceangail agus catalytic nucleoside triphosphate (NTP) (20, 21).Co-chòrdail ris an amharc seo, faodar grunn phrìomh fhuigheall làraich gnìomhach anns an pseudokinase SelO bho Pseudomonas syringae a chruinneachadh leis an supercomplex SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 a chaidh fhoillseachadh o chionn ghoirid.Fuigheall Coronavirus NiRAN glèidhte air a chuir a-steach don mhicro-structar dealanach.Pròtain ath-chuingealaichte (17).Thathas a’ dèanamh tuairmeas gun toir an U / GMPylation clàraichte (fèin) staid neo-ghluasadach gus NMP a ghluasad chun t-substrate (16 neo-aithnichte an-dràsta), agus an coltas structarail eadar NiRAN agus protein kinase (17, 19) ) An e am beachd a th’ ann. Bidh NiRAN ag atharrachadh phròtainean eile.
Tha mòran fheartan, a’ toirt a-steach a cheangal eagraichte gun samhail le bhìorasan neadachaidh agus dealachadh ginteil bho RdRp, a’ dèanamh NiRAN na phrìomh einnsean riaghlaidh reusanta airson bhìorasan neadachaidh, a tha deatamach airson an nochdadh agus an dearbh-aithne.Roimhe sin, chaidh trì gnìomhan a dh’ fhaodadh a bhith an sàs ann an NiRAN gus eadar-theangachadh genome / subgenomic no ath-riochdachadh / ath-sgrìobhadh a riaghladh.Nuair a thathar a’ beachdachadh air an dàta gann agus neo-choileanta a bha ri fhaighinn aig an àm, tha na buannachdan agus na h-eas-bhuannachdan aig gach gnìomh (16).Anns an rannsachadh seo, tha sinn ag amas air na sgrùdaidhean bith-cheimiceach agus ginteil air ais air na coronaviruses a tha a’ riochdachadh an dà ghinealach a chur còmhla, agus ar co-dhùnaidhean a chuir ann an cùl-raon mean-fhàs de mhùthadh nàdurrach teaghlach coronavirus, gus sealladh fhaighinn air an rìoghachd Dhìomhair seo.Bidh sinn ag aithris air adhartasan mòra ann an tuigse NiRAN tro bhith ag aithneachadh thargaidean nàdarra ann an RTC, a tha (am measg nan trì barailean a tha rim faighinn) a’ cur ri àite an raoin seo ann a bhith a’ tòiseachadh synthesis RNA bhìoras neadachaidh.Tha an rannsachadh seo cuideachd a’ fosgladh chothroman airson dreuchdan eile aig NiRAN air an eadar-aghaidh aoigheachd bhìoras.
Gus feartan enzymatic an àrainn NiRAN co-cheangailte ri bhìoras corona nsp12 a chomharrachadh, thug sinn a-mach cruth ath-mheasgaichte de coronavirus daonna 229E (HCoV-229E) nsp12 ann an E. coli, le tag His6 aig an C-terminus, agus chuir sinn còmhla an pròtain le [α32-P ] Incubate còmhla ri NTP an làthair MnCl2 mar a chaidh a mhìneachadh ann an Stuthan agus Dòighean.Sheall mion-sgrùdadh air toradh ath-bhualadh gu robh pròtain radiolabeled ann a’ co-imrich le nsp12 (106 kDa), a’ nochdadh gu bheil coronavirus nsp12 a’ catalachadh cruthachadh pròtain covalent-NMP addducts, air a chruthachadh le roghainn le uridine monophosphate (UMP) (Figear 1A) Agus B).Sheall mion-sgrùdadh cainneachdail, an taca ri nucleotides eile, gun do mheudaich dian chomharran cuir a-steach UMP 2 gu 3 tursan (Figear 1C).Tha an dàta seo co-chòrdail ris a’ ghnìomhachd tar-chuir NMP a tha dùil ann an raon NiRAN den coronavirus (16), ach tha e a’ nochdadh gu bheil na roghainnean nucleotide ann an àrainn NiRAN den coronavirus agus am bhìoras arterial eadar-dhealaichte.
Gnìomh fèin-NMPylation de HCoV-229E nsp12.(A) Chaidh HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) a thoirt a-steach leis an [α-32P] NTP ainmichte an làthair 6 mM MnCl2 airson 30 mionaidean (faic Stuthan agus Dòighean airson mion-fhiosrachadh).Chaidh na toraidhean ath-bhualadh a sgaradh le SDS-PAGE agus an dath le gorm sgoinneil Coomassie.(B) Tha am pròtain radiolabeled air fhaicinn le ìomhaighean fosfair.Tha suidheachadh nsp12-His6 agus comharran tomad moileciuil pròtain (ann an kilodaltons) air an sealltainn ann an A agus B. (C) Chaidh dian a ’chomharra rèidio-beò (meanbh ± SEM) a dhearbhadh bho thrì deuchainnean neo-eisimeileach.*P≤0.05.Tha neart nan comharran (ceudad) co-cheangailte ri UTP.
Ged a chaidh sealltainn gu bheil gnìomhachd enzyme co-cheangailte ri NiRAN riatanach airson ath-riochdachadh EAV agus SARS-CoV ann an cultar cealla (16), cha deach gnìomh sònraichte NiRAN agus targaidean a dh’ fhaodadh a bhith air an co-dhùnadh fhathast.Thug an coltas structarail a chaidh aithris o chionn ghoirid eadar NiRAN agus teaghlach de phròtainean le pasgain coltach ri kinase pròtain (17, 22) sinn gu bhith a’ dèanamh deuchainn air a ’bheachd gu bheil NiRAN a’ catalachadh NMPylation de phròtainean eile.Chruthaich sinn seata de thargaidean homologous a dh’fhaodadh a bhith ann, a’ toirt a-steach pròtanan neo-structarail air an còdachadh le HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), anns gach fear le taga C-terminal His6 (eàrr-ràdh SI, Clàr S1), Agus goir na pròtanan sin le [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P] UTP) an làthair no às aonais nsp12.Bha albumin serum bovine agus pròtain fusion MBP-LacZα air a thoirt a-mach ann an E. coli mar smachdan (Figear 2A, slighean 1 gu 7).Chaidh am pròtain radiolabeled a sgrùdadh le electrophoresis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) agus autoradiography, agus chaidh a lorg gu robh comharra rèidio-beò làidir anns an ath-bhualadh anns an robh nsp12 agus nsp9.Tha suidheachadh a’ chomharra a’ freagairt ri tomad moileciuil nsp9, a’ nochdadh UMPylation nsp12-mediated de nsp9 (Figear 2B, slighe 7).Cha deach pròtanan deuchainn sam bith eile a lorg gun robh UMPylated, a thug oirnn co-dhùnadh gur e substrate sònraichte de nsp12 a th’ ann an nsp9.Co-chòrdail ris an dàta fèin-NMPylation a chithear ann am Figear 1, tha nsp12 comasach air na ceithir NMPan a ghluasad gu nsp9, ged a tha an èifeachdas eadar-dhealaichte, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP)) ( Dealbh).3 A agus B).Fo na cumhaichean a thathar a’ cleachdadh san assay seo (giorrachadh an ath-bhualadh agus an ùine nochdaidh, lughdaich dùmhlachd nsp12; stuthan agus dòighean), cha b’ urrainnear fèin-NMPylation nsp12 a lorg (dèan coimeas eadar Figear 2B, sreath 7, agus Figear 1B), a air a dhearbhadh gu robh UMP èifeachdach (Agus ioma-chuairtean) air a ghluasad bho nsp12 gu nsp9.Feumaidh gnìomhachd UMP transferase làthaireachd ions Mn2 +, mar a chithear ann am Figear 3C, fhad ‘s nach deach ach glè bheag de ghnìomhachd tar-chuir UMP fhaicinn an làthair Mg2 +, agus cha deach gnìomhachd sam bith an làthair an dà cation divalent eile a chaidh a dhearbhadh.Chaidh dàta coltach ris fhaighinn ann am measaidhean NMPylation anns a bheil cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), agus adenosine triphosphate (ATP) (eàrr-ràdh SI, Figear S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation de nsp9.Chaidh sreath de fho-stratan pròtain (a’ toirt a-steach serum albumin bovine, MBP-lacZα, agus sreath de HCoV-229E nsps le bileagan le C-terminal His6 air a chòdachadh le ORF1a) a chleachdadh gus gnìomhachd UMPylation de HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated a mheasadh. pròtain.Thoir am pròtain le [α-32P] UTP airson 10 mionaidean às aonais (A) no làthaireachd (B) de nsp12 mar a chaidh a mhìneachadh anns na stuthan agus na dòighean-obrach.Aig mullach A agus B, tha gel SDS-polyacrylamide air a dhath le Coomassie Brilliant Blue air a shealltainn, agus aig bonn A agus B, tha na autoradiograms co-fhreagarrach air an sealltainn.Tha suidheachadh a’ chomharra mòr moileciuil pròtain (ann an kilodaltons) air a thoirt seachad air an taobh chlì.Tha suidheachadh nsp12-His6 (B, mullach) agus an comharra rèidio-beò a chaidh fhaicinn nuair a chaidh nsp12-His6 le nsp9-His6 (B, sreath 7) a chomharrachadh cuideachd, a tha a’ nochdadh gu bheil [α-32P] UMP gu nsp9-His6 (12.9 kDa), nach deach fhaicinn airson pròtanan eile a chaidh a dhearbhadh.
HCoV-229E NiRAN-meadhanaichte comharrachadh bith-cheimiceach agus virological de nsp9 NMPylation.(A agus B) Dreuchd a’ cho-substrate nucleotide a thathar a’ cleachdadh san ath-bhualadh.Tha Nsp12-His6 agus nsp9-His6 measgaichte agus air an gortachadh an làthair diofar [α-32P] NTPn anns an assay àbhaisteach NMPylation.(A, mullach) Coomassie-dathte nsp9-His6 air a sgaradh le SDS-PAGE.(A, bonn) Autoradiograph den aon raon den gel.(B) Tha an gnìomhachd coimeasach (ciall ± SEM) an làthair an cofactor nucleotide ainmichte air a dhearbhadh bho thrì deuchainnean neo-eisimeileach.*P≤0.05.(C) Dreuchd ianan meatailt.Air a shealltainn tha an deuchainn NMPylation àbhaisteach an làthair [α-32P] UTP agus diofar ianan meatailt, gach fear le dùmhlachd de 1 mM.Ann an C, gu h-àrd, tha Coomassie dhathte nsp9-His6 air a shealltainn, agus ann an C, gu h-ìosal, tha an autoradiography co-fhreagarrach air a shealltainn.Tha meud a’ phròtain le bileag (ann an kilodaltons) ri fhaicinn air taobh clì A agus C. (D) Tha an cruth mutant de HCoV-229E nsp12-His6 a’ giùlan an ionaid aminoideach ainmichte ann an [α-32P] UTP, mar a chaidh a mhìneachadh. ann an Stuthan agus Dòighean.Tha an radiolabeled nsp9-His6 a chaidh a thoirt a-mach anns an ath-bhualadh NMPylation air a lorg le ìomhaighean fosphorylation (D, mullach).Tha an gnìomhachd coimeasach an coimeas ris a 'phròtain seòrsa fiadhaich (wt) air a shealltainn ann an D, agus tha a' bhonn air a thoirt mar chuibheasachd (±SEM) bho thrì deuchainnean neo-eisimeileach.Tha reultan a’ nochdadh gu bheil fuigheall neo-ghlèidhte air a chur an àite.(E) Fhuair an titer bhìoras ann an cultar supernatant de cheallan p1 24 uair às deidh galar a bhith air a dhearbhadh le assay plac.Tha na h-ionadan codon ann an raon NiRAN den mutant einnseanaichte HCoV-229E air an comharrachadh (tha àireamh fuigheall stèidhichte air an t-suidheachadh aca ann am pp1ab).Chaidh an làrach gnìomhach RdRp le dìth mac-samhail nsp12_DD4823/4AA a chleachdadh mar smachd.
Gus tuigse nas doimhne fhaighinn air làrach gnìomhach NiRAN agus faighinn a-mach na fuigheall co-cheangailte ri gnìomhachd tar-chuir NMP sònraichte nsp9, rinn sinn mion-sgrùdadh mùthaidh, anns an do chuir sinn an àite na fuigheall glèidhidh ann an motifan NiRAN AN, BN agus CN ( 16) Is e Ala (eàrr-ràdh SI, Figear S2).A bharrachd air an sin, chaidh buaidh luchd-ionaid Arg-to-Lys no Lys-to-Arg glèidhteach a mheasadh ann an dà chùis.Mar smachd (àicheil), thèid Ala a chuir an àite fuigheall nach eil no nas lugha air an gleidheadh ann an raon NiRAN de coronaviruses agus bhìorasan neadachaidh eile. Bidh BN) agus D4280A (CN) gu mòr a’ lughdachadh no eadhon a’ cuir às do nsp9 NMPylation tro nsp12, fhad ‘s a tha pròtanan le luchd-ionaid glèidhteachais (R4178K), K4116R) a’ cumail 60% agus 80% den ghnìomhachd aca, a tha a’ nochdadh gu bheil fois nan cuingeachaidhean air an taobh aca fhèin. tha slabhraidhean mothachail gu corporra (Figear 3D).Tha a bhith a’ cur an àite grunn fuigheall glèidhte eile E4145A, D4273A, F4281A agus D4283A mòran nas lugha de chron, agus chan eil nsp9 UMPylation ach air a lughdachadh gu meadhanach.Chaidh toraidhean co-chosmhail fhaighinn ann an ath-bheachdan nsp9 NMPylation a ’toirt a-steach NTPn eile (Figear 3D agus eàrr-ràdh SI, Figear S3), a’ dearbhadh gu bheil na buaidhean a chaidh fhaicinn air ionadan sònraichte aminoideach neo-eisimeileach bhon t-seòrsa co-substrate nucleotide a thathas a ’cleachdadh.An uairsin, rinn sinn deuchainn air a’ bhuaidh a dh’ fhaodadh a bhith aig na h-ionadan nsp12 sin air ath-riochdachadh coronaviruses ann an cultar cealla.Chun na crìche seo, chleachd sinn teamplaidean DNA co-phàirteach iomchaidh a chaidh an innleachadh gu ginteil (cDNA) air an clonadh ann am bhìoras vaccinia ath-chuingealaichte (23, 24) gus ceallan 5 -7 ath-sgrìobhadh.Sheall tomhas de ghine bhìoras gabhaltach a chaidh a thoirt a-mach anns na ceallan sin nach robh a’ mhòr-chuid de mutants HCoV-229E NiRAN ion-dhèanta (Figear 3E).Tha buidheann de mutants viral neo-sheasmhach a’ toirt a-steach roghainnean eile a chaidh a dhearbhadh gus cuir às no lughdachadh mòr air gnìomhachd tar-chuir NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ach tha dà roghainn eile ann (K4116R, E4145A) 8 % glèidhte?Tha an gnìomhachd NMPylation in vitro aca a’ moladh gu bheil bacaidhean a bharrachd an sàs.San aon dòigh, thug dà mhùthadh eile (R4178K, F4281A) a dh’ adhbhraich lùghdachadh meadhanach ann an gnìomhachd in vitro NMPylation aig NiRAN bhìorasan beò, ge-tà, lughdaich na bhìorasan sin ìrean gu mòr tro ath-riochdachadh.Co-chòrdail ris an dàta gnìomhachd in vitro a chithear ann am Figear 3D, a’ dol an àite ceithir fuigheall eile nach eil air an gleidheadh ann an coronavirus agus / no bhìorasan neadachaidh eile (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) thug iad a-mach bhìorasan obrachail An sliochd, a dh’ aindeoin gu robh iad titer meadhanach nas lugha an coimeas ris a’ bhìoras seòrsa fiadhaich (Figear 3E).
Gus sgrùdadh a dhèanamh a bheil gnìomhachd tar-chuir NMP le meadhan NiRAN an urra ris an raon gnìomhach RdRp, chaidh Ala a chuir an àite an dà fhuigheall Asp glèidhte a tha an sàs ann an co-òrdanachadh ions meatailt divalent (11) ann an RdRp motif C. a ghnìomhachd nsp9 NMPylation, a 'sealltainn nach eil feum air gnìomhachd polymerase nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation gnìomhachd (Pàrtaidh IR, Figear S4).
Às deidh dhuinn gnìomhachd tar-chuir NMP sònraichte nsp9 a stèidheachadh airson nsp12, dh’ fheuch sinn ri cur-ris NMP-nsp9 a chomharrachadh le mòr-speactrometry (MS).Sheall an speactram mòr pròtain iomlan de HCoV-229E nsp9 ath-leasaichte mullach aig 12,045 Da (Figear 4A).Cha do dh’atharraich cur-ris nsp12 càileachd nsp9, a’ nochdadh nach biodh nsp12 agus nsp9 nan iom-fhillte seasmhach fo na cumhaichean a chaidh a chleachdadh (dì-nàdarachadh) (Figear 4A).Ann an làthaireachd UTP agus GTP, sheall tomhas mòr an ath-bhualadh anns an robh nsp9 agus nsp12 fa leth gun do ghluais meud pròtain UTP 306 Da, agus ghluais meud pròtain GTP 345 Da, a’ nochdadh gu bheil gach moileciuil nsp9 a’ ceangal UMP no GMP. (Dealbh 4) C agus D).Thathas a’ dèanamh tuairmeas gu bheil an lùth a tha a dhìth airson nsp9 NMPylation le meadhan NiRAN a’ tighinn bho hydrolysis NTP agus sgaoileadh pyrophosphate.Ged a chaidh cus molar 10-fhillte de nsp9 (targaid) na nsp12 (enzyme) a chleachdadh san ath-bhualadh seo, chaidh NMPylation de nsp9 a bha cha mhòr coileanta fhaicinn, a’ nochdadh gu bheil an eadar-obrachadh eadar nsp12 agus nsp9 geàrr-ùine, agus faodaidh nsp12 NMPylate barrachd nsp9 moileciuil in vitro.
NMPylation singilte de nsp9 an làthair nsp12 agus UTP no GTP.Air a shealltainn tha an speactram mòr pròtain iomlan de HCoV-229E nsp9 (eàrr-ràdh SI, Clàr S1) (AD).(A) nsp9 a-mhàin, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 an làthair UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 an làthair GTP.
Gus na fuigheall nsp9 UMPylated le nsp12 a dhearbhadh, chaidh nsp9-UMP a ghlanadh le trypsin.Chaidh na peptides a thàinig às a sin a sgaradh le cromatagrafaidheachd liùlach nano-àrd-choileanadh (HPLC) agus chaidh an sgrùdadh le mòr-speactrometry tandem (MS / MS) air-loidhne.Sheall mion-sgrùdadh dàta a’ cleachdadh pasgan bathar-bog Byonic (Protein Metrics) UMPylation den aminoidid N-terminal.Tha seo air a dhearbhadh le làimh.Nochd an speactram mòr tandem den peptide ro-làimh [UMP] NNEIMPGK (eàrr-ràdh SI, Figear S5A) criomag aig 421 m / z, a’ nochdadh gu bheil UMP a ’ceangal ri fuigheall 1 de nsp9.
Aig ceann-uidhe N nsp9, tha Asn air a ghleidheadh am measg buill Orthocoronavirinae (eàrr-ràdh IR, Figear S6).Ged a tha sinn den bheachd gur e am prìomh nitrigin amine N-terminal an neach-gabhail as coltaiche airson UMP, chuir sinn romhainn fianais a bharrachd fhaighinn mu cheangal NMP aig an N-terminal.Air an adhbhar seo, chaidh am peptide N-terminal nsp9 neo-NMPylated agus NMPylated a chaidh a ghlanadh le HPLC a thoirt a-mach an làthair acetone agus sodium cyanoborohydride.Fo na cumhaichean sin, chan urrainnear ach amines bun-sgoile an-asgaidh atharrachadh le propyl (25).Tha dà phrìomh amine anns a’ pheptide stèidhichte air N-terminal nsp9 leis an t-sreath NNEIMPGK, aon aig ceann-uidhe N Asn agus am fear eile aig slabhraidh taobh Lys aig an C-terminus.Mar sin, faodar buidhnean propyl a thoirt a-steach aig gach ceann.Tha na cromatagraman ion a chaidh a thoirt a-mach de pheptidean neo-NMPylated air an sealltainn anns a’ phàipear-taice SI, Figear S5B.Mar a bhiodh dùil, faodar N-terminal agus C-terminal (mono) propylated (eàrr-ràdh SI, Figear S5B, sreath àrd) agus peptides dipropylated (eàrr-ràdh SI, Figear S5B, sreath ìosal) a chomharrachadh.Bidh am pàtran seo ag atharrachadh le bhith a’ cleachdadh an peptide N-terminal NMPylated de nsp9.Anns a 'chùis seo, chan urrainnear ach peptides propylated C-terminal a chomharrachadh, ach chan eil peptides propylated N-terminal agus peptides dipropylated air an comharrachadh ( Pàipear-taice IR, Figear S5C), a' nochdadh gu bheil UMP air a ghluasad chun an N-terminal amine bun-sgoile Gus casg a chur air seo. buidheann bho bhith a’ dèanamh atharrachaidhean.
An uairsin, cuiridh sinn Ala no Ser an àite (le Ala no Ser) no sguabaidh sinn às na fuigheall glèidhte aig N-terminus nsp9 gus cuingeadan sònraichte a mhìneachadh.Stèidhichte air an dàta MS againn a ’sealltainn gu bheil NiRAN a’ cruthachadh nsp9-NMP adduct leis a ’phrìomh amine den fhuigheall N-terminal de nsp9, bha sinn a’ smaoineachadh gu bheil nsp9 NMPylation ag iarraidh air a ’mhaighstir viral protease (Mpro, nsp5) an nsp9 N-terminal a leigeil ma sgaoil bho an ro-ruithear polyprotein aige.Gus am beachd seo a dhearbhadh, thug sinn a-mach pròtain ro-làimh nsp7-11 anns an robh nsp9 ann an E. coli agus rinn sinn deuchainn àbhaisteach NMPylation an làthair [α-32P] UTP (stuthan agus dòighean).Mar a chithear ann am Figear 5A (sreath 3), chan eil an ro-ruithear nsp7-11 gun ghearradh air a radiolabeled le nsp12.An coimeas ri sin, ma thèid nsp7-11 a ghlanadh le nsp5 ath-chuimseach gus nsp9 (agus nsps eile) a leigeil ma sgaoil bhon ro-ruithear, lorgar pròtain radiolabeled a bhios a ’dèanamh imrich le nsp9, a’ dearbhadh ar co-dhùnadh gu bheil NiRAN agus N- Cruthachadh roghnach de stuthan covalent nsp9-NMP .Amine bun-sgoile ceann-uidhe an N-terminal Asn (suidheachadh 3825 ann am pp1a/pp1ab).Tha an co-dhùnadh seo cuideachd a’ faighinn taic bho dheuchainnean a’ cleachdadh an togail nsp9, anns a bheil fuigheall no dhà a bharrachd aig an N-terminus.Anns an dà chùis, chaidh cur às do UMPylation de nsp9 le NiRAN-mediated (Pàrtaidh IR, Figear S7).An uairsin, thug sinn a-mach pròtain le aon no dhà de fhuigheall Asn air a dhubhadh às bhon t-sreath peptide 3825-NNEIMPK-3832 aig an N-terminal de nsp9.Anns gach cùis, chaidh nsp9 UMPylation a bhacadh gu tur (Figear 5B), a’ toirt seachad fianais a bharrachd gu bheil an fhìor nsp9 N-terminus ag obair mar ghlacadair NMP.
Giullachd proteolytic nsp9 agus àite fuigheall N-terminal ann an UMPylation le meadhan nsp12.(A) Feumaidh nsp9 UMPylation crìoch nsp9 N an-asgaidh.Tha Nsp7-11-His6 air a ghintinn ro-làimh aig 30 ° C ann am bufair lorg NMPylation anns a bheil UTP an làthair no às aonais Mpro ath-chuimseach (nsp5-His6).Às deidh 3 uairean, tòisich air assay NMPylation le bhith a’ cur nsp12-His6 ris mar a chaidh a mhìneachadh ann an Stuthan agus Dòighean.Chaidh am freagairt anns a bheil nsp5-His6 (sreath 1) agus nsp9-His6 (sreath 2) a chleachdadh mar smachd.Às deidh 10 mionaidean, chaidh am freagairt a thoirt gu crìch agus chaidh am measgachadh freagairt a sgaradh le SDS-PAGE.Bha am pròtain air a dhath le Coomassie Brilliant Blue (A, mullach).Tha an ro-ruithear Nsp7-11-His6 agus an toradh giullaichte mar thoradh air sgoltadh meadhanach nsp5-His6 air an taobh dheas.Thoir an aire (mar thoradh air cho beag 'sa tha iad) nach eil nsp7 agus nsp11-His6 rim faighinn anns an gel seo, agus tha an ath-bhualadh air a chur ris le nsp5-His6 (sreathan 1 agus 4; tha suidheachadh nsp5-His6 air a chomharrachadh le cearcall cruaidh) no nsp9-His6 (Lane 2) a’ toirt a-steach beagan de MBP (air a chomharrachadh le cearcallan fosgailte) mar neo-chunbhalachd fuigheall oir tha iad air an cur an cèill mar phròtainean fusion MBP (eàrr-ràdh SI, Clàr S1).(B) Tha dìth aon no dhà de fhuigheall Asn aig Nsp9-His6 (àireamh fuigheall a rèir an t-suidheachaidh ann am pp1a / pp1ab) agus tha e air a ghlanadh agus air a bhrosnachadh le nsp12-His6 agus [α-32P] UTP.Tha B, SDS-PAGE air a dhath le Coomassie air a shealltainn aig a’ mhullach, B, tha an autoradiograph co-fhreagarrach air a shealltainn aig a’ bhonn.Tha suidheachadh a’ chomharra cuideam moileciuil (ann an kilodaltons) ri fhaicinn air an taobh chlì.(C) Chaidh Ala no Ser a chuir an àite fuigheall glèidhte HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal, agus chaidh an aon uiread de phròtain a chleachdadh anns an ath-bhualadh UMPylation meadhanaichte nsp12-His6.Chaidh na toraidhean ath-bhualadh a sgaradh le SDS-PAGE agus a dhath le Coomassie Brilliant Blue (C, mullach), agus chaidh radiolabeled nsp9-His6 a lorg le ìomhaighean fosphorescence (C, meadhan).A 'cleachdadh pròtain seòrsa fiadhaich (wt) mar iomradh (seata gu 100%), chaidh an gnìomhachd NMPylation càirdeach (ciall ± SEM) a thomhas bho thrì deuchainnean neo-eisimeileach.(D) Chaidh titers bhìoras ann an cultar cealla p1 supernatant de cheallan Huh-7 air an robh ceallan Huh-7 de sheòrsa fiadhaich HCoV-229E, agus mutants a ’giùlan ionadan aminoideach ainmichte ann an nsp9 a dhearbhadh le assay plac.Chaidh am motif RdRp le dìth mac-samhail C dùbailte mutant DD4823 / 4AA a chleachdadh mar smachd àicheil.
Tha an ceann-uidhe N de nsp9 (gu sònraichte dreuchdan 1, 2, 3, agus 6) glè ghlèidhte am measg buill den fho-theaghlach Orthocoronavirinae (eàrr-ràdh IR, Figear S6).Gus sgrùdadh a dhèanamh air an àite a dh’ fhaodadh a bhith aig na fuigheall sin ann an nsp12-mediated nsp9 NMPylation, chaidh Ala no Ser (aonar no còmhla) a chuir an àite dà fhuigheall Asn an dèidh a chèile aig ceann-uidhe N nsp9.An coimeas ri seòrsa fiadhaich nsp9, le bhith a’ cur Ala no Ser an àite N3825 thàinig lùghdachadh dà-fhillte air UMPylation nsp12-mediated (Figear 5C).Co-chòrdail ris a’ cho-dhùnadh againn gu bheil NMPylation a’ tachairt aig an amine bun-sgoile N-terminal an àite an t-sèine taobh den fhuigheall N-terminal, chunnaic sinn NMPylation fuigheall mòr le bhith a’ cur an àite N3825A agus N3825S.Gu inntinneach, ma thèid Ala no Ser a chuir an àite an dàrna Asn, tha nsp9 UMPylation air a lughdachadh nas làidire (barrachd air 10 tursan), fhad ‘s nach eil ach buaidh meadhanach aig an àite Ala aig dreuchdan 3, 4, agus 6 air nsp9 UMPylation (Figear 2). ).5C).Chaidh toraidhean co-chosmhail fhaighinn a’ cleachdadh ATP, CTP no GTP (eàrr-ràdh IR, Figear S8).Còmhla, tha an dàta seo a’ nochdadh prìomh àite N2826 (suidheachadh 2 ann an nsp9) ann an nsp9 NMPylation.
Gus fianais a bharrachd fhaighinn mun cho-dhàimh gnìomh eadar ceann-uidhe N nsp9 agus NMPylation, rinn sinn co-thaobhadh ioma-sreath (MSA) den t-sreath nsp9 den teaghlach Coronavirus (eadar-dhealaichte eadar fuigheall 104 agus 113) (Pàrtaidh IR, Figear). S6).Gu h-iomlan, ann an 47 gnè (aithnichte agus tuairmeasach) de 5 ginean den fho-theaghlach Orthocoronavirinae a bhios a’ toirt buaidh air diofar mhamalan, eòin, agus luchd-aoigheachd snàgairean, cha deach ach fuigheall 8 gu h-iomlan a lorg nach robh eadar-dhealaichte.Chaidh na h-atharrachaidhean as fharsainge, a’ gabhail a-steach cuir às agus cuir a-steach, fhaicinn anns na cuairtean eadar na h-eileamaidean structar àrd-sgoile de nsp9, mar a chaidh a dhearbhadh le sgrùdaidhean structarail roimhe (26 ??28).Chaidh còig fuigheall caochlaideach a lorg anns an t-sreath β agus α helix den phàirt C-terminal de nsp9.Tha trì fuigheall caochlaideach a’ dèanamh suas motif NNE de cheann-uidhe N nsp9.Thathas ag innse gur e an dàrna Asn den motif seo an aon fhuigheall caochlaideach, a tha cuideachd air a cho-roinn leis an nsp9 beachd-bharail den coronavirus losgann a tha fada air falbh, agus a tha a’ riochdachadh gnè Microhyla letovirus 1 anns an subfamily Letovirinae de Alphaletovirus.Faodar glèidhteachas fuigheall ann an eileamaidean structar àrd-sgoile nsp9 a reusanachadh le beachdachadh structarail gus feartan fillte no ceangail RNA aithnichte a chumail suas.Ach, chan eil coltas gu bheil an reusanachadh seo a’ buntainn ri glèidhteachas NNE, agus ron sgrùdadh seo, bha nàdar nan cuingeadan a tha a’ cuingealachadh atharrachadh an t-sreath tripeptide gu tur falaichte.
Gus faighinn a-mach dè cho cudromach sa tha nsp9-NMPylation agus glèidhteachas NNE ann an ath-riochdachadh coronavirus, thug sinn a-mach mutants HCoV-229E, anns a bheil luchd-ionaid singilte no dùbailte de fhuigheall nsp9 N-terminal, a’ nochdadh gu bheil nsp9 NMPylation cronail in vitro.Mus tòisich sinn, feuchaidh sinn ris a’ cheist a fhreagairt a bheil na h-ionadan sin (faisg air làrach cleavage nsp8 | 9) a’ toirt buaidh air giollachd proteolytic na roinne C-terminal pp1a.Chaidh seata de dhealbhaidhean polyprotein nsp7-11 anns an robh luchd-ionaid co-fhreagarrach aig ceann-uidhe N nsp9 a thoirt gu buil ann an E. coli agus chaidh a ghearradh le Mpro ath-cho-fhillte.Chan eilear a’ toirt buaidh mhòr air sgaradh proteolytic nan ceithir làraich (a’ gabhail a-steach làrach taobh an nsp9) le luchd-ionaid sam bith a chaidh a thoirt a-steach (eàrr-ràdh IR, Figear S9), às aonais atharrachaidhean structarail anns na pròtanan sin a tha a’ cur bacadh air Mpro-mediated nsp8 | 9 cleavage (No eile). làrach-lìn.
Chaidh ceallan Huh-7 a thionndadh le RNA fad genome HCoV-229E, a’ còdachadh luchd-ionaid Ala no Ser anns na tripeptides NNE glèidhte (N3825, N3826, agus E3827) aig ceann-uidhe nsp9 N, a’ sealltainn gu bheil a’ mhòr-chuid de na mùthaidhean marbhtach.B’ urrainn dhuinn am bhìoras a shàbhaladh le bhith a’ cur an àite Ser no Ala den N-terminal Asn (N2835A no N2835S), ach cha d’ fhuair sinn air ais am bhìoras le mùthaidhean singilte is dùbailte eile ann an sreath NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figear 5D).
Tha na co-dhùnaidhean sin a’ nochdadh gu bheil ath-riochdachadh coronaviruses ann an cultar clò air a chuingealachadh (an aon rud no coltach), a’ cuingealachadh mùthadh nàdurrach làraich nsp9 NMPylation anns a’ bhodhaig, agus a’ toirt taic do phrìomh àite na freagairt seo ann an cearcall beatha coronaviruses.
Anns an t-seata dheuchainnean mu dheireadh, thug sinn a-mach C-terminal His6 le bileagan SARS-CoV-2 nsp12 agus nsp9, agus dà chruth mutant de nsp12 ann an E. coli.B’ e na fuigheall làraich gnìomhach ann an raointean NiRAN agus RdRp Cleachd Ala an àite sin (Figear 6A agus eàrr-ràdh SI, Clàr S2).Tha K4465 ann an SARS-CoV-2 nsp12 a’ freagairt ri K4135 ann an HCoV-229E (Pàrtaidh IR, Figear S2), a chaidh a dhearbhadh a bhith riatanach airson gnìomhachd NiRAN agus mac-samhail HCoV-229E (Figear 3D agus E).Tha am fuigheall seo cuideachd a rèir fuigheall bhìoras arterial EAV nsp9 K94, a chaidh a dhearbhadh roimhe seo a bhith riatanach airson fèin-UMPylation / self-GMPylation NiRAN (16).Mar a chithear ann am Figear 6B, tha gnìomhachd tar-chuir UMP aig SARS-CoV-2 nsp12 a’ cleachdadh nsp9 mar fho-strat, fhad ‘s a tha am mutant làrach gnìomhach nsp12_K4465A neo-ghnìomhach.Chan eil an ionadachadh dùbailte ann an sreath caractar SDD de motif C RdRp a’ toirt buaidh air gnìomhachd UMP transferase (Figear 6B), a’ nochdadh nach eil buaidh dhìreach aig gnìomhachd RdRp ann an nsp9 UMPylation.Chaidh dàta coltach ris fhaighinn a’ cleachdadh CTP, GTP agus ATP (eàrr-ràdh IR, Figear S10).Ann an geàrr-chunntas, tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil gnìomhachd glèidhidh aig nsp9 NMPylation le NiRAN-meadhanaichte ann an coronaviruses a’ riochdachadh diofar ghinean den fho-theaghlach orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation de nsp9.(A) Gel SDS-polyacrylamide dhathte le Coomassie a’ sealltainn a’ phròtain ath-chuimseach a chaidh a chleachdadh anns an deuchainn NMPylation.Mar smachd, chaidh pròtain mutant le ionadachadh làrach gnìomhach ann an àrainn NiRAN (K4465A) agus fearann RdRp (DD5152 / 3AA) de SARS-CoV-2 nsp12 a chleachdadh.Tha àireamh fuigheall stèidhichte air suidheachadh ann am pp1ab.(B) Autoradiograph de lorg UMPylation a’ cleachdadh nsp9-His6 agus [α-32P] UTP mar fho-strat nsp12-His6 (seòrsa fiadhaich [wt] agus mutant).Tha tomad moileciuil (ann an kilodaltons) den phròtain le bileag air a shealltainn air an taobh chlì.
Tha raointean NiRAN mar as trice air an gleidheadh ann an Nidovirales (16), a’ nochdadh gu bheil iad a’ catalachadh ath-bheachdan enzymatic a tha riatanach airson mac-samhail Nidovirus.Anns an sgrùdadh seo, bha e comasach dhuinn dearbhadh gu bheil àrainn NiRAN den coronavirus a’ gluasad NMP (air a ghineadh bho NTP) gu nsp9, pròtain dìomhair ceangail RNA a tha an sàs ann an ath-riochdachadh bhìoras (26 ?? 29 ), gus a dhearbhadh mar thargaid nàdurrach agus com-pàirtiche de coronavirus RTC.
Tha fearann NiRAN a’ roinn trì motifan sreath (AN, BN, agus CN), anns a bheil àireamh glè bheag de dh’ fhuigheall a tha glèidhte anns a h-uile teaghlach ann an òrdugh Nidovirales monophyletic ach eadar-dhealaichte (8, 16).Tha sgrùdaidhean o chionn ghoirid air sealltainn gu bheil iad ceangailte gu structarail ri teaghlach gu ìre mhòr neo-aithnichte de phròtainean coltach ri kinase, ris an canar an teaghlach SelO an toiseach (17, 19, 22, 30, 31).Tha pasgain kinase aig pròtanan co-cheangailte ri SelO, ach chan eil grunn fhuigheall làraich gnìomhach glèidhte ann an kinases clasaigeach (22, 32).Stèidhichte air an taobh cùil de mholacilean ATP ceangailte ris an làrach gnìomhach agus air a dhèanamh seasmhach le eadar-obrachaidhean sònraichte, chaidh beachd a thoirt air SelO agus chaidh a dhearbhadh às deidh sin gun deidheadh AMP (an àite fosfat) a ghluasad gu substrate pròtain (22), fhad ‘s a tha pròtain bacterial eile coltach ri SelO aig YdiU. o chionn ghoirid chaidh sealltainn gu bheil e a’ brosnachadh ceangal covalent UMP ri Tyr agus na tha air fhàgail de dhiofar fho-stratan pròtain (33).
Gus dearbhadh agus leudachadh a dhèanamh air an ro-innse mu na tha air fhàgail de làrach gnìomhach an àrainn coronavirus NiRAN, chleachd sinn dòighean bith-cheimiceach agus gintinneachd cùil gus mion-sgrùdadh mùthaidh a dhèanamh air an coronavirus nsp12 (Figear 3D agus E agus eàrr-ràdh SI, Figear S3 agus clàr) S1â S4).Tha an dàta a’ sealltainn gu bheil cur an àite HCoV-229E K4135, R4178 agus D4280 le Ala a’ cur às do ghnìomhachd in vitro NMP transferase agus ath-riochdachadh bhìoras ann an cultar cealla (Figear 3D agus E agus eàrr-ràdhan SI, Figear S3), a’ toirt taic don làthaireachd aca ann an NTP γ-phosphate (K4135, R4178) agus co-òrdanachadh ianan meatailt làraich gnìomhach (D4280).Chaidh sealltainn gu bheil ionadachadh E4145A den Glu glèidhte ann an raon bhìoras nead an eun a bhathas an dùil suidheachadh K4135 (17) a dhèanamh seasmhach, a’ cuir às do ath-riochdachadh viral, ach gu h-iongantach, chaidh a’ ghnìomhachd a chumail anns an in vitro assay NMPylation (Figear 3D agus E agus Pàipear-taice SI, Figear S3 Agus Clàran S1–S4).Chaidh an aon bheachd a dhèanamh nuair a chaidh an ionadachadh co-fhreagarrach a thoirt a-steach ann an homolog YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).Air an gabhail còmhla, tha an dàta seo a’ toirt taic do dhleastanas riaghlaidh a’ chòrr ghlèidhte seo seach a’ ghnìomh catalytach.
Le bhith a’ cur an àite fuigheall Phe glèidhte (F4281A) taobh a-staigh raon nestovirus ann an àrainn HCoV-229E NiRAN (8) thàinig lùghdachadh ann an gnìomhachd NMPylation in vitro agus lùghdachadh mòr ann an ath-riochdachadh bhìoras ann an cultar cealla (Figear 3D, E agus SI) pàipear-taice, Figear S3).Tha an dàta co-chòrdail ri gnìomh riaghlaidh cudromach na fuigheall seo, leithid am motif homologous DFG Phe reidue a chaidh a shealltainn roimhe.Ann an kinases pròtain clasaigeach, tha e na phàirt den lùb ceangail Mg2 + agus a ’cuideachadh le bhith a’ cruinneachadh agus a ’riaghladh an spine???Riatanach airson gnìomhachd catalytic èifeachdach (32, 34).Le bhith a’ cur a-steach Ala agus Arg airson fuigheall K4116 (ann am motif preAN), fa leth, chuir iad às do mhac-samhail viral agus, mar a bhiodh dùil, bha buaidhean eadar-dhealaichte aige air gnìomhachd tar-chuir NMP in vitro, a rèir an t-sreath taobh aminoideach a chaidh a thoirt a-steach (Figear 3D agus E agus eàrr-ràdhan SI). , Figear S3).Tha an dàta gnìomh co-chòrdail ris an fhiosrachadh structarail, a 'sealltainn gu bheil am fuigheall seo air eadar-obrachadh a stèidheachadh le ATP phosphate (17).Ann an raon NiRAN de theaghlaichean bhìoras neadachaidh eile, tha Lys, Arg no His (8) a’ fuireach ann an suidheachadh HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116, a’ nochdadh gu bheil cuingealachadh gnìomh a’ chòrr sònraichte seo air a bhith socair.Tha cuir an àite D4188A agus D4283A a’ cuir às no a’ lughdachadh gnìomhachd enzyme gu làidir agus a’ cuir às do mhac-samhail bhìoras (Figear 3).Tha an dà fhuigheall seo air an gleidheadh anns a’ mhòr-chuid (ach chan eil a h-uile gin) bhìorasan neadachaidh (8), a’ nochdadh gnìomh cudromach a tha sònraichte don teaghlach ach is dòcha neo-catalytic.Chaidh ionadan Ala bho ghrunn fhuigheall Lys agus Asp eile (K4113A, D4180A, D4197A agus D4273A) nach eil air an gleidheadh anns na Coronaviridae no teaghlaichean Nestioviridae eile (8) a chleachdadh mar smachdan.Mar a bhiodh dùil, tha na h-ionadan sin gu ìre mhòr fulangach, le lùghdachadh beag ann an gnìomhachd enzyme agus ath-riochdachadh viral ann an cuid de chùisean (Figear 3 agus eàrr-ràdh SI, Figear S3).Gu h-iomlan, tha an dàta mutagenesis coronavirus gu math co-chòrdail ris an dàta fèin-GMP agus cùl-fhiosrachadh ginteil de EAV NiRAN-RdRp (16), anns a bheil fuigheall EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (a rèir gnìomhan cudromach HCoV-229E K4135), R124 (a 'freagairt ri R4178), D132 (a' freagairt ri D4188), D165 (a 'freagairt ri D4280), F166 (a' freagairt ri F4281).A bharrachd air an sin, tha dàta mutagenesis HCoV-229E co-chòrdail ri agus air a leudachadh bhon dàta gintinneachd cùil SARS-CoV a chaidh aithris roimhe (16), a cheart cho glè choltach ris an fheadhainn a chaidh fhaicinn airson an motif CN co-fhreagarrach Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The. phenotype air a mhìneachadh -F219A agus HCoV-229E_F4281A (Figear 3 D agus E agus eàrr-ràdh SI, Figear S3 agus Clàr S1-S4).
An coimeas ri orthologs EAV (16), aig a bheil roghainn soilleir airson UTP agus GTP (anns an ath-bhualadh fèin-NMPylation), tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gum faod an àrainn coronavirus NiRAN (air a riochdachadh le HCoV-229E agus SARS-CoV-2) a bhith èifeachdach. air a ghluasad Na ceithir NMPan, ged a tha beagan roghainn ann airson UMP (Figear 1 agus 3).Tha sònrachas coimeasach ìosal an co-substrate sònraichte NTP co-chòrdail ris an structar supercomposite SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 a chaidh aithris o chionn ghoirid, anns a bheil ADP-Mg2+ a’ ceangal ri làrach gnìomhach NiRAN, ach chan ann le adenine Part de chruthachadh eadar-obrachaidhean sònraichte (17).Anns an sgrùdadh againn, chan eil buaidh eadar-dhealaichte aig an t-seòrsa nucleotide a chaidh a chleachdadh ann an ath-bhualadh NMPylation air gnìomhachd a ’phròtain mutant (Pàrtaidh IR, Figear S3), a’ nochdadh nach eil gin de na fuigheall sin ceangailte gu dlùth ri ceangal nucleobase sònraichte.Tha fhathast ri sgrùdadh a dhèanamh air bunait structarail agus cudromachd bith-eòlasach nan diofar roghainnean co-substrate NTP a chaidh fhaicinn ann an raointean NiRAN de coronaviruses agus bhìorasan arterial;faodaidh iad a bhith fìor no faodaidh iad a bhith mar thoradh air cuingealachaidhean nan sgrùdaidhean aca.Aig an àm seo, chan urrainnear a chuir a-mach gu bheil roghainn co-substrate eadar-dhealaichte aig gnìomhachd NMPylator a dh’ fhaodadh a bhith ann an àrainn bhìoras arterial NiRAN (an taca ris a ’ghnìomhachd fèin-NMPylation a bha air a chomharrachadh roimhe), a’ toirt aire gu bheil an aon rud eadar an arterial agus an coronavirus Tha fearann NiRAN aig an ìre as àirde.Dèan coimeas stèidhichte air sreath (16).An coimeas ris an pseudokinase SelO, a bhios a’ cleachdadh Mg2 + mar chofactor, tha gnìomhachd coronavirus agus bhìoras arterial NiRAN an urra ri Mn2 + (16) (Figear 3C agus eàrr-ràdh SI, Figear S1).Tha an eisimeileachd Mn2+ agus an roghainn fhollaiseach airson UTP na fheart neo-àbhaisteach de phròtain NMPylators, agus cha deach a dhearbhadh ach o chionn ghoirid ann am pròtain YdiU de Salmonella typhimurium, a bhios a’ catalachadh UMPylation chaperone pròtain teann Mn2 +-eisimeil gus ceallan a dhìon bho inntrigeadh cuideam amar Cell ATP ( 33).
Tha an coltas structarail a chaidh a mhìneachadh o chionn ghoirid eadar fearann coronavirus NiRAN agus kinases pròtain ceallach (17, 19) a’ toirt taic a bharrachd do chomas NiRAN gus NMP a cheangal gu covalently ri pròtanan eile a tha sinn air aithris san sgrùdadh seo.Chuir sinn fòcas air an rannsachadh againn airson targaidean NiRAN a dh’ fhaodadh a bhith air na pròtanan a chaidh an còdachadh le HCoV-229E ORF1a, a tha fios gu bheil iad a’ cuideachadh gu dìreach no gu neo-dhìreach ri mac-samhail còd ORF1b aig RTC (12, 35).Tha na deuchainnean againn a’ toirt seachad fianais chinnteach airson NMPylation èifeachdach agus sònraichte nsp9 (Figear 2).Ma thèid am pròtain targaid a chleachdadh ann an cus molar a tha 8 gu 10 tursan nas àirde na an enzyme (nsp12), thathas a’ dearbhadh gu bheil nsp9 gu tur (mono) NMPized (Figear 4).Cho-dhùin sinn gu bheil an eadar-obrachadh eadar nsp12 agus nsp9 geàrr-ùine agus nach bi e na ionad seasmhach le nsp9 (às aonais fo-aonadan RTC eile).Tha an co-dhùnadh seo a’ faighinn taic bho sgrùdaidhean eadar-obrachadh pròtain air proteome SARS-CoV (35).Chomharraich mion-sgrùdadh MS am prìomh amine den fhuigheall N-terminal de nsp9 mar làrach NMPylation (eàrr-ràdh IR, Figear S5).Tha cruthachadh a ’cheangail phosphoramidate agus a’ bhuidheann amino-crìochnachaidh N a ’dèanamh eadar-dhealachadh air gnìomhachd NMPylation le meadhan NiRAN bhon ath-bhualadh AMPylation Pseudomonas syringae SelO-mediated, a bhios a’ brosnachadh cruthachadh AMP ceangailte ri O aig Ser, Thr, no fuigheall Tyr Peptide adduct ( 22), agus tha S. typhimurium YdiU a' cruthachadh stuthan peptide-UMP ceangailte ri O-cheangailte (le Tyr) agus N-ceangailte (leis His).Tha am fiosrachadh cuibhrichte a tha ri fhaighinn mu theaghlach pròtainean SelO a’ nochdadh gu bheil buill den teaghlach phròtain mòr seo gu math eadar-dhealaichte ann an cruthachadh peptide-NMP adducts.Is e sealladh inntinneach a tha seo a tha airidh air tuilleadh sgrùdaidh.
Thug an dàta a fhuair sinn san sgrùdadh seo oirnn beachd a ghabhail gu bheil feum aig NMPylation de nsp9 air ceann-uidhe N an-asgaidh.Ann an co-theacsa ath-riochdachadh viral, thèid seo a thoirt seachad le bhith a’ sgoltadh proteolytic làrach giollachd nsp8 | nsp9 anns an mac-samhail polyprotein pp1a air a mheadhanachadh le Mpro agus pp1ab.Anns a ’mhòr-chuid de coronaviruses, is e Asn an eadar-dhealachadh eadar an làrach shònraichte seo (VKLQ | NNEI ann an HCoV-229E) agus a h-uile làrach cleavage Mpro coronavirus eile (seach fuigheall beag eile, leithid Ala, Ser Or Gly) ann am P1â???Àite (36).Sheall an dàta cleavage peptide a fhuaireadh anns na sgrùdaidhean tràth gu robh èifeachdas glanaidh làrach nsp8 | nsp9 nas ìsle na làraich làraich eile, a’ nochdadh 1) gum faodadh àite riaghlaidh a bhith aig an làrach shònraichte seo ann an giullachd ùineail co-òrdanaichte an C-terminal. roinn pp1a, no 2) a Dreuchd a’ cheann-uidhe nsp9 N glèidhte sònraichte ann an ath-riochdachadh bhìoras (37).Sheall an dàta againn (Figear 5A) gun deach an cruth ath-chuingealaichte de nsp9 a bha a’ giùlan an fhìor shreath N-terminal a NMPized gu h-èifeachdach le nsp12.Chaidh an t-sreath taobh N-terminal a thoirt air falbh le factar Xa (nsp9-His6; eàrr-ràdh SI, Clàr S1) no cleavage Mpro-mediated (nsp7-11-His6; Figear 5A agus eàrr-ràdh SI, Clàr S1).Gu cudromach, sheall an ro-ruithear anns an robh nsp9 neo-ghearraichte nsp7-11-His6 an aghaidh NMPylation de nsp12, a tha co-chòrdail ris an dàta againn, a’ nochdadh gu bheil an t-adduct nsp9-NMP air a chruthachadh tro amine bun-sgoile N-terminal (eàrr-ràdh SI, Figear S5) .Gus tuigse nas doimhne fhaighinn air sònrachas substrate NiRAN, chuir sinn fòcas an uairsin air na tha air fhàgail de N-terminal faisg air làimh de nsp9.Às aonais pròtainean eile, tha iad sùbailte a thaobh structarail, gan casg bho bhith air an lorg ann an cruth neo-ainmichte nsp9 (26 28, 38), a’ nochdadh an eadar-dhealachadh nàdarra cuibhrichte aca Tha seo mar thoradh air an t-sreath chudromach a tha sònraichte (chan e structar àrd-sgoile) gnìomh a’ chriomag nsp9 N-terminal.Tha luchd-ionaid Ala de fhuigheall glèidhte san roinn seo (Figear 5C agus D agus eàrr-ràdh SI, Figear S8) a’ nochdadh gu bheil N3826 riatanach airson nsp9 NMPylation in vitro, fhad ‘s a tha luchd-ionaid N3825A agus E3827A a’ leantainn gu lùghdachadh ann an NMPylation, fhad ‘s nach eil luchd-ionaid M3829A agus P3830A .Gu follaiseach buaidh a thoirt air nsp9 NMPylation.Ged nach eil ach buaidh meadhanach aig ionadachadh N-terminal Asn (N3825A, N3825S) air nsp9 NMPylation agus ath-riochdachadh bhìoras ann an cultar cealla (Figear 5C agus D), cuir às do shreath fuigheall Asn bhon dipeptide N-terminal 3825-NN air a dhearbhadh gu bheil e marbhtach do bhìorasan, a’ nochdadh gu bheil feum air aon fhuigheall Asn ro fuigheall eile aig an N-terminus, mas fheàrr Asn, ged a tha e coltach gum faodar gabhail ri pàirt de dh’ fuigheall coltach ris (Figear 5B, C, agus D).Tha sinn a’ co-dhùnadh gu bheil an dipeptide 3825-NN, gu sònraichte am fuigheall N3826 glèidhte agus riatanach taobh a-staigh raon coronavirus (eàrr-ràdh IR, Figear S6), a’ dèanamh cinnteach gu bheil ceangal agus stiùireadh ceart an nsp9 N-terminus ann an làrach gnìomhach NiRAN.
Le bhith a’ cur Ala (E3827A) an àite Glu glèidhte de gach fo-theaghlach tha nsp9 NMPylation in vitro ach tha e marbhtach do bhìorasan ann an cultar cealla (Figear 5C agus D), a’ nochdadh gnìomh a bharrachd an fhuigheall seo, mar eisimpleir, ann am prìomh eadar-obrachaidhean (NMPylated no gun atharrachadh). ) nsp9 N-terminus agus nithean eile a tha an lùib ath-riochdachadh bhìoras.Cha tug mùthaidhean Nsp9 buaidh air pròiseas proteolytic nsp9 no nsps sam bith a bha faisg air làimh (39) (Pàrtaidh IR, Figear S9), a’ nochdadh nach robh na phenotypes marbhtach de ghrunn mhùthaidhean nsp9 a chaidh an sgrùdadh air adhbhrachadh le dì-riaghladh sgìre pròiseas-crìochnachaidh proteolytic C pp1a .
Tha an dàta gu h-àrd a’ toirt seachad fianais, às deidh làimhseachadh Mpro-mediated air làrach glanaidh nsp8 | 9 ann am pp1a/pp1ab, gum faodar an ceann-uidhe N de nsp9 a bhith UMPylated (no air atharrachadh gu ìre le NMP eile).A bharrachd air an sin, mar thoradh air glèidhteachas sàr-mhath an N-terminus de nsp9 (a’ toirt a-steach fuigheall Asn singilte agus caochlaideach anns an teaghlach coronavirus) agus an dàta gintinneachd cùil a fhuaireadh san sgrùdadh seo (Figearan 3E agus 5D) thàinig sinn gu co-dhùnadh gu bheil an tuairisgeul nsp9 NMPylation tha e co-cheangailte ri bith-eòlas agus riatanach airson ath-riochdachadh coronavirus.Tha builean gnìomh an atharrachaidh seo fhathast ri sgrùdadh, mar eisimpleir, a thaobh gnìomhachd ceangail RNA nsp9 (cruth neo-atharraichte) a chaidh a mhìneachadh roimhe (neo-shònraichte) (2628).Faodaidh NMPylation N-terminal cuideachd buaidh a thoirt air eadar-obrachadh nsp9 le substrates pròtain no RNA no cruthachadh co-chruinneachaidhean ceithir-ìre eadar-dhealaichte.Chaidh iad sin fhaicinn ann an sgrùdaidhean structarail agus chaidh an dearbhadh gu bheil iad ceangailte gu gnìomhach ri ath-riochdachadh coronavirus, ged a tha iad gu sònraichte às aonais A thaobh an atharrachaidh seo (26- ââ29, 40).
Ged a dh’ fheumar sònrachas targaid an àrainn coronavirus NiRAN a chomharrachadh nas mionaidiche fhathast, tha an dàta againn a ’sealltainn gu bheil sònrachas targaid pròtain ann an àrainn coronavirus NiRAN gu math cumhang.Ged a tha glèidhteachas prìomh fhuigheall làraich gnìomhach (8, 16) ann an raon NiRAN de gach teaghlach nidovirus a’ toirt taic làidir do ghnìomhachd an NMPylator glèidhte na pròtanan sin, tha dearbh-aithne na tha air fhàgail den phòcaid ceangail substrate den raon seo Glèidhteachas agus glèidhteachas fhathast ri chomharrachadh. , agus faodaidh iad a bhith eadar-dhealaichte eadar teaghlaichean eadar-dhealaichte airson adhbharan Nidovirales.San aon dòigh, cha deach targaidean buntainneach bhìorasan neadachaidh eile a dhearbhadh fhathast.Faodaidh iad a bhith nan orthologs iomallach de nsp9 no pròtainean eile, leis gu bheil na sreathan taobh a-muigh nan còig raointean mac-samhail a tha mar as trice air an gleidheadh ann am bhìorasan neadachaidh nas lugha de ghleidheadh (8), a’ toirt a-steach an raon genome eadar Mpro agus NiRAN, Nam measg, tha nsp9 suidhichte anns an coròna-bhìoras.
A bharrachd air an sin, chan urrainn dhuinn an-dràsta a bhith a’ diùltadh a ’chomas gu bheil targaidean a bharrachd (a’ toirt a-steach ceallach) aig àrainn NiRAN.Anns a ’chùis seo, is fhiach a ràdh gu bheil coltas gu bheil“ prìomh riaghladairean ”aig na homologues bacterial anns a’ phròtain seo a tha a ’tighinn am bàrr NMPylators (NMPylators) (30, 31)?Bidh NMP ag atharrachadh grunn phròtainean ceallach gus na gnìomhan sìos an abhainn aca a riaghladh no a chuir às, agus mar sin a’ cluich pàirt ann an grunn phròiseasan bith-eòlasach, leithid freagairt cuideam cealla agus homeostasis redox (22, 33).
Anns an sgrùdadh seo (Figear 2 agus 4 agus Pàipear-taice SI, Figearan S3 agus S5), bha e comasach dhuinn dearbhadh gun do ghluais nsp12 am pàirt UMP (NMP) gu suidheachadh singilte (glèidhte) ann an nsp9, fhad ‘s nach deach pròtanan eile atharrachadh anns an Air a chleachdadh Fo na cumhaichean, thathas a’ toirt taic do shònrachas substrate a tha air a dheagh mhìneachadh (seach a bhith sgaoilte).Co-chòrdail ri seo, an taca ri N-terminal nsp9 NMPylation, tha gnìomhachd NMPylation nsp12 fhèin gu math ìosal, feumaidh an lorg aige ùine nochdaidh fèin-radiography nas fhaide, agus thathas a’ cleachdadh àrdachadh 10-fhillte ann an dùmhlachd nsp12.A bharrachd air an sin, cha do shoirbhich leis an anailis MS againn fianais a thoirt seachad airson NMPylation de nsp12, a tha a’ nochdadh gur e gnìomhachd àrd-sgoile (aig a ’char as fheàrr) a th’ ann an fèin-NMPylation àrainn NiRAN.Ach, bu chòir a thoirt fa-near gu bheil sgrùdaidhean eile air fianais tòiseachaidh a thoirt seachad gum faodadh inbhe fèin-AMPylation de NMPylator bacterial smachd a chumail air an gnìomhachd NMPylation aca air fo-stratan pròtain eile (22, 33).Mar sin, tha feum air barrachd rannsachaidh gus sgrùdadh a dhèanamh air na buaidhean gnìomh a dh’ fhaodadh a bhith aig gnìomhan fèin-NMPylation a chaidh aithris airson EAV nsp9 (16) agus coronavirus nsp12 (an sgrùdadh seo), a’ toirt a-steach a’ bhuaidh a tha san amharc coltach ri chaperone air pasgadh an àrainn C-terminal RdRp ( 16)).
Roimhe seo, chaidh beachdachadh air grunn bharailean a thaobh gnìomhan sìos an abhainn a dh’ fhaodadh a bhith aig fearann nidoviral NiRAN, a ’toirt a-steach RNA ligase, guanylate transferase capped RNA agus gnìomhachd prìomhadh pròtain (16), ach chan eil gin dhiubh co-chosmhail ris na gnìomhan sìos an abhainn a tha rim faighinn.Tha am fiosrachadh a gheibhear anns na dreuchdan a leanas dìreach aig an aon àm gun a bhith a’ dèanamh barailean a bharrachd.Tha an dàta a gheibhear san sgrùdadh seo nas cunbhalaiche le (ach chan urrainn dha a dhearbhadh) gu bheil àrainn NiRAN an sàs ann a bhith a’ tòiseachadh synthesis RNA air a bhrosnachadh le pròtain.Bhathar a’ creidsinn roimhe seo gu robh gnìomh àrainn NiRAN ann an 5 ??Chan eil iad sin agus Taic bho dhàta eile a’ toirt buaidh air capadh ²-RNA no ath-bheachdan ceangail RNA.Mar sin, mar eisimpleir, thathas den bheachd gu bheil làrach gnìomhach NiRAN a’ toirt a-steach an Asp glèidhte mar bhunait coitcheann (D252 ann am Pseudomonas syringae SelO; D4271 ann an HCoV-229E pp1ab; D208 ann an SARS-CoV-2 nsp12) (Iar-ràdh , figear 2). ).S2) (17, 22, 33), fhad ‘s a tha an catalysis anns an RNA ligase RNA a tha an urra ri ATP agus enzyme capping RNA air a dhèanamh leis an enzyme covalent- (lysyl-N) -NMP intermediate, a tha a’ toirt a-steach fuigheall Lys nach eil air atharrachadh ( 41).A bharrachd air an sin, tha sònrachas iongantach stèidhichte air sreath den coronavirus NiRAN airson targaidean pròtain glèidhte agus an sònrachas socair airson co-substrates NTP (is fheàrr leis UTP) an aghaidh enzyme capaidh le meadhan NiRAN no gnìomhan coltach ri RNA ligase.
Gu dearbh, tha feum air tòrr obrach a bharrachd gus dearbhadh agus, ma thèid a dhearbhadh, mion-sgrùdadh a dhèanamh air a’ phàirt a dh’ fhaodadh a bhith aig nsp9-UMP (nsp9-NMP) ann an synthesis RNA air a bhrosnachadh le pròtain, a cheanglas grunn aithisgean inntinneach ach (gu ruige seo) a chaidh aithris roimhe. .Seallaidhean iomallach.Mar eisimpleir, chaidh a dhearbhadh gu bheil deireadh an RNA àicheil de coronavirus a’ tòiseachadh le dualan oligo (U) (42, 43).Tha an amharc seo co-chòrdail ris a’ bheachd gu bheil an synthesis de RNA dualan àicheil air a thòiseachadh le bhith a’ ceangal an fhoirm UMPylated de nsp9 ris an earball poly(A) ( triggers), a dh’ fhaodadh a bhith air a bhrosnachadh leis a’ cheangal RNA aige. pròtain RTC eile.Faodar an earrann UMP a thug nsp9 seachad an uairsin a chleachdadh mar “primer” airson oligouridylation le meadhan nsp7/8/nsp12, a’ cleachdadh an earbaill 3 ??²-poly(A) anns an RNA genomic no sreath eile oligo (A) anns a bheil a’ frithealadh mar theamplaid, coltach ris an uidheamachd a chaidh a stèidheachadh airson pròtain VPg picornavirus (44).Dè ma tha am moladh “neo-riaghailteach”????Tha tòiseachadh an synthesis RNA àicheil (air a bhrosnachadh le pròtain) a’ toirt seachad ceangal ris na beachdan, a’ nochdadh gu bheil UMP (an àite UTP) aig an RNA dualan àicheil coronavirus aig a cheann (42), a thathas a’ meas a tha a’ nochdadh gu bheil an Bidh searbhag niuclasach Dicer a’ sgoltadh an deireadh fosphorylate le endonuclease neo-aithnichte a tha sònraichte do urdine.Ma thèid a dhearbhadh, faodaidh an gnìomhachd hydrolytic searbhag niuclasach seo cuideachadh le bhith a’ leigeil ma sgaoil an cruth UMPylated oligomeric de nsp9 bho cheann 5 ² an t-sreath àicheil nascent.Tha an àite a dh’ fhaodadh a bhith aig nsp9 ann am prìomhachadh pròtain cuideachd co-chòrdail ri sgrùdaidhean gintinneachd cùil roimhe, a tha air sealltainn gu bheil nsp9 (agus nsp8) ag eadar-obrachadh gu breithneachail agus gu sònraichte leis an eileamaid RNA cis-act glèidhte faisg air deireadh 3 an genoma coronavirus.45).A rèir na h-aithisg seo, faodar a-nis ath-sgrùdadh agus leudachadh a dhèanamh air na beachdan sin roimhe seo tro sgrùdadh a bharrachd.
Ann an geàrr-chunntas, cho-dhùin an dàta againn gnìomhachd sònraichte taga einnsein bhìoras neadachaidh seilbh ceangailte ri RdRp aig an N-terminus.Ann an coronavirus, thathas a ’cleachdadh a’ ghnìomhachd UMPylator / NMPylator seo a chaidh a lorg às ùr le NiRAN gus a bhith an urra ri Mn2 + agus fuigheall Asn a tha faisg air làimh agus ag adhbhrachadh cruthachadh bannan phosphoramidate (lùth ìosal) leis a ’phrìomh amine N-terminal.Tro sgaradh Mpro-mediated aig làrach glanaidh nsp8 | 9, faodar an targaid nsp9 a chleachdadh airson NMPylation, a’ nochdadh a’ cho-cheangail gnìomh eadar am protease agus àrainn NiRAN, a tha a’ leudachadh gu RdRp.Tha glèidhteachas prìomh fhuigheall ann an làrach gnìomhach nsp12 NiRAN agus an targaid nsp9, còmhla ri dàta a fhuaireadh bho dhà coronaviruses a ’toirt a-steach SARS-CoV-2, a’ toirt seachad fianais làidir gu bheil nsp9 NMPylation na coronavirus Tha feartan Tòraidheach cuideachd nam prìomh cheum ann an ath-riochdachadh bhìoras.Tha an dàta a tha ri fhaighinn gar toirt gu co-dhùnadh gu bheil àite sònraichte cruth NMPylated de nsp9 ann an synthesis RNA air a bhrosnachadh le pròtain na shuidheachadh reusanta airson coronavirus agus bhìorasan neadachaidh eile, agus faodaidh NiRAN cuideachd cuimseachadh air pròtanan neo-aithnichte eile.A 'riaghladh a' bhìoras.Eadar-obrachadh aoigheachd.Ma thèid a dhearbhadh, àrdaichidh com-pàirt luchd-pròtain ann an synthesis RNA viral an dàimh sreath de raointean Mpro / 3CLpro agus RdRp eadar an coròna-bhìoras a chaidh a lorg roimhe agus supergroup coltach ri picornavirus (9), a tha a-nis air aonachadh anns na Pisonivirites a chaidh a stèidheachadh o chionn ghoirid (9). 46) san roinn-seòrsa.
Tha an dàta againn cuideachd a’ sealltainn gum faodar na gnìomhan enzyme bunaiteach, roghnach agus glèidhidh a chaidh an comharrachadh san sgrùdadh seo a chleachdadh mar thargaidean airson drogaichean anti-bhìorasach.Faodar todhar a chuireas bacadh air ceangal (agus atharrachadh às deidh sin) den cheann-uidhe glèidhte nsp9 N ann an làrach gnìomhach NiRAN a leasachadh gu bhith nan drogaichean anti-bhìorasach èifeachdach agus ioma-ghnìomhach, a tha freagarrach airson làimhseachadh coronaviruses bheathaichean is daonna bho dhiofar (fo) gnè Infections , a’ toirt a-steach SARS-CoV-2 agus Coronavirus Syndrome analach an Ear Mheadhanach.
Chaidh an t-sreath còdaidh den phròtain coronavirus a chaidh a thoirt a-mach san sgrùdadh seo a mheudachadh le RT-PCR a’ cleachdadh RNA air a sgaradh bho Huh-7 le galair HCoV-229E no Vero E6 le SARS-CoV-2, agus air a chuir a-steach a’ cleachdadh modhan clonaidh àbhaisteach.pMAL-c2 (Obair-lann Bith-eòlais New England) no vectar abairt pASK3-Ub-CHis6 (47) (Pàrtaidh IR, Clàran S1 agus S2).Chaidh luchd-ionaid codon singilte a thoirt a-steach le mutagenesis stèidhichte air làrach PCR (48).Gus am pròtain fusion MBP a thoirt gu buil, chaidh ceallan E. coli TB1 atharrachadh leis an structar plasmid pMAL-c2 iomchaidh (eàrr-ràdh SI, Clàr S1).Chaidh am pròtain fusion a ghlanadh le cromatagrafaidheachd dàimh amylose agus air a ghlanadh le factar Xa.Às deidh sin, chaidh am pròtain tagged C-terminal His6 a ghlanadh le cromatagrafaidheachd dàimh meatailt Ni-immobilized (Ni-IMAC) mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (49).Gus am pròtain fusion ubiquitin a thoirt gu buil, chleachd ceallan E. coli TB1 an structar plasmid pASK3-Ub-CHis6 iomchaidh (Pàrlamaid IR, Clàran S1 agus S2) agus còdachadh DNA plasmid pCGI ubiquitin-sònraichte C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Cruth-atharrachadh (47).Chaidh am pròtain coronavirus le tag C-T6 aige a ghlanadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (50).
Chaidh an deuchainn fèin-NMPylation de HCoV-229E nsp12-His6 a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh ann an EAV nsp9 (16).Ann an ùine ghoirid, tha nsp12-His6 (0.5 µM) a’ toirt a-steach 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µMate bha an NTP ainmichte agus 0.17 µM a’ maidseadh [α32-P] NTP (3,000 Ci / mmol; Hartmann Analytic) aig 30 ° C airson 30 mionaidean.Anns a h-uile measadh NMPylation (àbhaisteach) eile de nsp12-mediated nsp9 NMPylation, tha na cumhaichean freagairt air an atharrachadh mar a leanas: nsp12-His6 (0.05 µM) agus nsp9-His6 (4 µM) an làthair 50 mM HEPES-KOH (pH 8. ), chomharraich 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM NTP, agus 0.17 µM a’ maidseadh [α32-P] NTP.Às deidh goir airson 10 mionaidean aig 30 ° C, chaidh an sampall ath-bhualadh a mheasgachadh le bufair sampall SDS-PAGE: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glicerol agus 0.005% bromophenol gorm.Chaidh am pròtain a dhì-nàdarachadh le teasachadh aig 90 ° C airson 5 mionaidean agus air a sgaradh le 12% SDS-PAGE.Tha an gel air a shuidheachadh agus air a dhath le fuasgladh Coomassie Brilliant Blue (40% methanol, 10% searbhag acetic, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), air a dhathachadh, agus fosgailte do scrion ìomhaighean fosphorescent airson 20 uair (gus nsp12 a lorg bho NMPylation) no (as àirde) 2 uair (airson measadh nsp9 NMPylation).Chaidh imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) a chleachdadh gus an scrion a sganadh agus chaidh ImageJ a chleachdadh gus dian nan comharran a sgrùdadh.
Airson mion-sgrùdadh MS, chaidh 1 µM nsp12-His6 agus 10 µM nsp9 (às aonais tag hexahistidine) a chleachdadh ann am mion-sgrùdadh NMPylation (eàrr-ràdh SI, Clàr S1) agus chaidh an dùmhlachd nas motha de 500 µM UTP agus GTP a chleachdadh.A rèir an dùmhlachd agus càileachd pròtain ris a bheil dùil, chaidh siostam HPLC H-Clas ACQUITY Waters uidheamaichte le colbh MassPrep (Waters) a chleachdadh gus 1 gu 10 µL de fhuasglaidhean pròtain bufair a dhì-ghalarachadh air-loidhne.Tha am pròtain dì-mhilleadh air a chuir a-steach don stòr ian electrospray de speactrometer mòr Synapt G2Si (Uisgeanan) tron chaisead a leanas de bufair A (uisge / 0.05% searbhag formic) agus bufair B (acetonitrile / 0.045% searbhag foirmeil), agus tha teòthachd a’ cholbh 60 ° C agus ìre sruth de 0.1 mL / min: elution gu isocratach le 5% A airson 2 mhionaid, an uairsin caisead sreathach gu 95% B taobh a-staigh 8 mionaidean, agus cùm 95% B airson 4 mionaidean eile.
Lorgar ionsan dearbhach le raon mòr de 500 gu 5000 m/z.Tha glu-fibrinopeptide B air a thomhas gach 45 diog airson ceartachadh gluasad mòr fèin-ghluasadach.Cleachd bathar-bog ionnstramaid MassLynx le leudachadh MaxEnt1 gus an speactram cuibheasach a thoirt air falbh às deidh a’ bhun-loidhne agus an rèidh a thoirt air falbh.
Chaidh UMPylated HCoV-229E nsp9 a chnàmh le bhith a’ cur trypsin atharraichte aig ìre seicheamh (Serva) ris agus air a ghoir thar oidhche aig 37 ° C.Chaidh colbh snìomh Chromabond C18WP (pàirt àireamh 730522; Macherey-Nagel) a chleachdadh gus na peptides a dhì-sailleadh agus a chuimseachadh.Mu dheireadh, chaidh am peptide a sgaoileadh ann an 25 µL de uisge, anns an robh 5% acetonitrile agus 0.1% searbhag foirmeil.
Chaidh na sampallan a sgrùdadh le MS a’ cleachdadh mòr-speactrometer Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).An siostam nanoâ HPLC mu dheireadh (Dionex), uidheamaichte le deireadh gnàthaichte 50 cm ??Colbh 75 μm C18 RP làn de ghrìogagan magnetach 2.4 μm (Dr. Albin Maisch Àrd-choileanadh LC GmbH) Ceangail ris an speactrometer mòr air-loidhne tro stòr nanospray Proxeon;stealladh 6 µL de fhuasgladh cnàmhaidh trypsin a-steach do thrast-thomhas a-staigh 300 µm × ??1 cm C18 PepMap colbh ro-dùmhlachadh (Thermo Scientific).A’ cleachdadh uisge / 0.05% searbhag formic mar an t-solusadair, chaidh an sampall a ghlacadh gu fèin-ghluasadach agus a dhì-sailleadh aig ìre sruth de 6 µL / min.
Chaidh na caiseadan a leanas de uisge / 0.05% searbhag foirmeil (solvent A) agus 80% acetonitrile / 0.045% searbhag foirmeil (solvent B) a chleachdadh gus dealachadh peptides tryptic aig ìre sruth de 300 nL / min: 4% B airson 5 mionaidean, an uairsin 30 A caisead sreathach gu 45% B taobh a-staigh mionaidean, agus àrdachadh sreathach gu 95% solvent B taobh a-staigh 5 mionaidean.Ceangail an colbh cromatagrafach ri nano-emitter de stàilinn gun staoin (Proxeon), agus spìon an eluent gu dìreach gu capillary teas an speactrometer mòr le comas 2,300 V. Tha an sgrùdadh sgrùdaidh le rùn de 60,000 anns an anailisiche mòr Orbitrap co-cheangailte. le co-dhiù trì sganaidhean MS/MS dàta, air an dùnadh a-mach gu dinamach airson 30 diogan, a’ cleachdadh dissociation air adhbhrachadh le bualadh ian sreathach no dissociation bualadh lùth nas àirde còmhla ri lorg orbitrap, is e an rùn 7,500.
Ùine puist: Lùnastal-03-2021